Mezzo di coltura

La componente minerale
La componente organica
Gli ormoni come protagonisti delle diverse fasi in vitro della micropropagazione (23.08.2012)
Caratteristiche di alcuni dei mezzi di coltura più utilizzati
Le condizioni ambientali della camera di crescita
La luce come fattore di crescita





Le cellule di organi vegetali o i tessuti della pianta stessa possono essere indotte a crescere ed a moltiplicarsi se poste in opportune condizioni ambientali. Le cellule, anche se prelevate da tessuti già differenziati, sono in grado di regredire la loro differenziazione sviluppando ammassi amorfi, callosi, che possono essere mantenuti in definitivamente in vitro o possono essere indotti a rigenerare organi o piante intere completamente differenziati. Oggi è possibile prelevare e coltivare in vitro un gran numero di cellule di diverse piante, anche se alcune varietà e specie risultano essere ancora recalcitranti ad una loro proliferazione in vitro. Ciò è dovuto non tanto a fattori genetici o biologici delle pianta o della cellula ma alla cattiva od errata scelta della condizioni colturali ed ambientali. Il substrato su cui si sviluppano le colture in vitro deve garantire che l’espianto abbia disponibilità di tutte le sostanze di cui questo necessita. In esso saranno pertanto disciolti elementi minerali, quali azoto, fosforo e potassio, che costituiscono i cosiddetti macroelementi, poiché necessari in quantità relativamente elevate. Tuttavia, per la sopravvivenza della pianta sono necessari anche altri elementi, sia pure in quantità minore: essi prendono il nome di microelementi ed i più importanti sono calcio, zolfo, magnesio, sodio, manganese, zinco, boro, iodio, molibdeno, rame, cobalto, ferro. Il substrato dovrà poi contenere una fonte di carbonio: a tale scopo si utilizza uno zucchero, generalmente il saccarosio. Inoltre, a seconda del tipo di espianto che si intende coltivare, potranno essere necessarie altre sostanze, quali aminoacidi, vitamine e soprattutto ormoni. Il substrato, previa verifica del pH (che generalmente deve oscillare intorno a 5.8) viene poi solidificato con l’aggiunta di agar, una specie di farina ottenuta da un’alga. Il tutto viene portato ad alta temperatura: in questo modo se ne ottiene anche la sterilizzazione, fondamentale per impedire lo sviluppo di muffe ed altri organismi saprofiti che potrebbero mettere a repentaglio la sopravvivenza stessa dell’espianto. Con il raffreddamento il substrato si solidifica ed assume un aspetto gelatinoso (quale quello di un budino): finalmente sarà possibile deporvi l’espianto, avendo cura di mantenere sempre l’assoluta sterilità all’interno del contenitore che si utilizza. In queste condizioni l’espianto si sviluppa ed origina una piantina in miniatura, la quale potrà fornire ulteriore materiale per successivi cicli di coltivazioni in vitro, oppure venire trasferita, con le opportune cautele, in condizioni di crescita più naturali.

La preparazione del substrato di crescita riveste un’importanza fondamentale in ogni fase in vitro del ciclo di propagazione. Per ogni specie e per ogni fase, infatti, vi è uno specifico substrato. La scelta degli elementi che devono far parte del substrato deve essere accurata sia nel tipo che nella concentrazione. Per le specie gia conosciute esistono delle formulazioni che portano il nome dei loro scopritori, il più noto dei quali è il Murashige & Skoog (1962) (M&S), mentre per le nuove specie che devono essere micropropagate, si deve procedere empiricamente e mettere a punto un substrato adatto.Essenzialmente in un substrato di crescita bisogna considerare:

1) la componente minerale;
2) la componente organica;



La componente minerale
La componente minerale è costituita da:

macroelementi: rappresentano i principali elementi indispensabili per la crescita delle piante e sono azoto, fosforo, potassio, calcio, magnesio, e zolfo. Le formulazioni con cui si possono utilizzare e le concentrazioni variano tra i vari substrati e dipendono dalla specie utilizzata.

microelementi: sono presenti nei substrati in piccole quantità, sono metalli, e hanno notevole importanza poiché svolgono un ruolo essenziale nei vari processi metabolici e fisiologici della pianta. I microelementi principali utilizzati per la micropropagazione sono ferro manganese, zinco, boro, rame, cobalto e molibdeno . Il ferro viene somministrato in forma di chelato (FeEDTA).


La componente organica.
La componente oraganica è rappresentata essenzialmente da:

1) carboidrati;
2) vitamine;
3) regolatori di crescita;
4) agar

1) I carboidrati: bisogna considerare che nell’ambiente in vitro i germogli non riescono ad espletare la normale attività di fotosintesi sia perché gli scambi gassosi sono ridotti per la presenza del film plastico che riveste il contenitore, quindi non riescono ad avere la giusta quantità di CO2, sia perchè l’intensità luminosa della camera di crescita è molto bassa. Di conseguenza per ovviare ad una insufficiente attività fotosintetica, si rende indispensabile la aggiunta al substrato di crescita del saccarosio, come sorgente energetica, in concentrazioni che oscillano intorno al 2-4%. L’ elevata presenza di zucchero riveste inoltre una notevole importanza anche nella regolazione del potenziale osmotico del mezzo di coltura, condizionando l’assimilazione dell’acqua e degli elementi nutritivi ed influenzando indirettamente la capacità di crescita dei tessuti. La presenza di zucchero nel mezzo di coltura, può essere rischioso da un punto di vista fitosanitario, creando un ambiente adatto per lo sviluppo di funghi e batteri. Oltre al saccarosio si possono somministrare altri zuccheri semplici come glucosio e fruttosio.

2) vitamine: svolgono, quando presenti, una funzione di cofattore della crescita entrando a far parte di diverse attività cellulari. Le più utilizzate sono tiamina (0,1-0,5 mg/l), mio-inositolo e biotina (0,1mg/l), acido nicotinico e piridossina.

3) regolatori della crescita: la presenza dei regolatori della crescita è il fattore che caratterizza la diverse fasi del ciclo di propagazione. Sebbene nelle piante gli ormoni non abbiano un’azione specifica, considerato che uno stesso effetto potrebbe essere stimolato da ormoni diversi, in alcune fasi la presenza di alcuni di essi influisce in maniera marcata sul tipo di risposta dei germogli. Nella micropropagazione gli ormoni più utilizzati sono:

· auxina
· citochinina
· gibberellina 

Oltre agli effetti prodotti dalla concentrazione dei singoli ormoni bisogna considerare il bilancio ormonale, cioè il rapporto tra le concentrazioni dei vari ormoni che in base alla fase in cui si opera, deve essere sbilanciato verso un tipo di ormone rispetto ad un altro, in relazione alle risposte che si desiderano. La concentrazione e le combinazioni in cui vengono utilizzati variano notevolmente in funzione della specie vegetale.

4) agar: un’altra importante componente organica del substarto di coltura è l’agar che conferisce allo stesso una consistenza gelatinosa; in questo modo è possibile mantenere i germogli in posizione eretta; questi viene aggiunto al substrato prima dell’autoclavazione a concentrazione di 5-7 g/l. Unico svantaggio è che rallenta la diffusione dei nutrienti all’interno del substrato, quindi i germogli possono assorbire solo gli elementi presenti intorno alla loro base. Per questo motivo il rinnovo del substrato si rende necessario e frequente. Altra componente organica che talvolta viene usata nella micropropagazione è la pectina che spesso è aggiunta al mezzo di coltura per ridurre i fenomeni di vitrescenza.


Gli ormoni come protagonisti delle diverse fasi in vitro della micropropagazione. (23.08.2012)
Il destino della cellula uovo fecondata, cioè il suo sviluppo e la sua differenziazione in un vegetale adulto pluricellulare, è determinato dalsuo corredo genetico. Molti fattori esterni interferiscono però con la espressio­ne della potenzialità genetica, condizionandola in vario modo. È noto in­fatti come due zigoti perfettamente identici sviluppino organismi molto di­versi se cresciuti in differenti condizioni ambientali. La luce, la temperatura, la presenza di parassiti, la competizione con altri organismi vicini sono alcuni dei fattori che condizionano l'espressione fenotipica del corredo genetico dello zigote vegetale. Così la mancanza di luce determina, spesso, un allungamento del fusto della pianta, la siccità del suolo provoca un aumen­to dell'apparato radicale, condizioni avverse di temperatura determinano un rallentamento dello sviluppo. Un ruolo di estrema importanza come regolatori della crescita e della differenziazione rivestono negli organismi  vegetali, così come in quelli animali, gli ormoni. Questi sono sostanze chimiche a struttura relativamente semplice che, prodotte in certe zone della pianta, in risposta ad opportuni stimoli sia interni che esterni, vengono traslocate in zone più o meno lon­tane ove condizionano le attività metaboliche delle cellule e quindi lo svi­luppo di tutto l'organismo. I fitormoni oggi conosciuti sono classificabili, in base alla funzione, in tre gruppi principali: auxine, gibberelline e citochining. Gli ormoni di cia­scuno di questi gruppi provocano un largo spettro di risposte biologiche da parte della pianta e questi spettri spesso si sovrappongono. Altri ormoni vegetali oggi conosciuti sono l'acido abscissico e Petilene.

Quando si parla di fitoregolatori o regolatori della crescita o più semplicemente di ormoni, ci riferiamo a sostanze che prodotte in piccole quantità stimolano, a distanza dalla zona di produzione, alcune attività fisiologiche della pianta. Nel campo della coltura in vitro la presenza di fitoregolatori nelle diverse fasi di crescita dei germogli, in particolar modo moltiplicazione e radicazione, spesso si rende necessaria per favorire alcuni processi di differenziamento dei tessuti che normalmente non accadrebbero. Gli ormoni più comunemente utilizzati sono auxina, citochinina e gibberellina. Il loro utilizzo, così come le  concentrazioni ed il tipo di formulazione, dipende dalla fase del ciclo in cui si opera e dalla specie trattata.



1) auxina: i primi effetti riconducibili alle auxine furono rilevati da Darwin nel suo “The power of movement in plants” (1880) in cui sottolineò che l’estremità apicale di una graminacea influenzava il movimento della pianta verso la luce. Went nel 1928 riconobbe che le sostanze che influenzavano il movimento verso la luce delle piante erano le auxine. Nel 1934 Thimann e Went scoprirono l’effetto dell’ auxina sulla radicazione delle talee. Sempre nel 1934 alle auxine fu associata la struttura chimica della acido-3-indolacetico IAA (Kogl et al).  Molti e diversi effetti delle auxine, sia sulla pianta integra che su tessuti e cellule coltivati in vitro, sono stati descritti. Esse determinano l'allungamento dei germogli. Ciò è dovuto alla sti­molazione della espansione cellulare, mentre la divisione cellulare non vie­ne in particolare stimolata. Stimolano la crescita delle radici. Il trattamento di talee con auxine è usato in agricoltura per indurre la emissione di radici avventizie. Inibiscono la caduta delle foglie. Giovani foglie producono in­fatti auxine ed il loro invecchiamento e distacco dalla pianta è in genere correlato con una diminuzione del contenuto di auxine. Non sembra invece che le auxine abbiano alcun effetto sulla crescita delle foglie stesse.  Promuovono la crescita dei frutti e ne impediscono il distacco dal­la pianta. Anche in questo caso la caduta del frutto è correlata con una di­minuzione del tasso auxinico. È una pratica corrente in agricoltura l'irro­razione dei frutti con auxine per impedirne il distacco dalla pianta sino al­la maturazione. Le auxine sono, inoltre, spesso usate per indurre la forma­zione di frutti partenocarpici. Determinano la dominanza apicale: le auxine prodotte dalla gem­ma apicale inibiscono infatti lo sviluppo delle gemme laterali; queste ultime possono quindi svilupparsi solo quando la gemma apicale viene recisa.  L'auxina, da sola o con altri ormoni, è indispensa­bile nei terreni di coltura per la crescita della maggior parte delle cellule vegetali. Qualche volta, ad esempio nel caso delle cellule tumorali  l'aggiunta è resa superflua dal fatto che le cellule stesse producono sufficienti quantità dell'ormone. In altri casi cellule che dipendono dalla aggiunta dell'ormone al terreno di coltura riescono, dopo successivi trasferimenti in terreni sempre più pove­ri di auxina, a rendersene indipendenti (cellule abituate). È dimostrato che ciò è dovuto al fatto che le cellule hanno acquisito la capacità di produrre esse stesse l'ormone. La spiegazione più logica di tale comportamento è che l'informazione genetica per la produzione di auxina sia presente anche sui cromosomi di quelle cellule che dipendono dalla sua aggiunta al terreno di coltura, ma che la espressione di questa informazione sia repressa da quello stesso meccanismo di controllo che nella pianta impedisce alla maggior par­te delle cellule di produrre auxina. Le cellule abituate sarebbero riuscite a rendere inoperante tale meccanismo di controllo. Qualcosa di simile, d'altra parte, si pensa succeda anche nel caso della trasformazione tumorale.È chiaro come la disponibilità di questi materiali biologici e la pos­sibilità di una loro coltivazione in vitro in condizioni strettamente control­late offra nuove interessanti possibilità per lo studio dei meccanismi di controllo della sintesi di auxina, per la individuazione di eventuali accettori dell'ormone e per la definizione del meccanismo con cui esso influenza il metabolismo cellulare.All’ IAA sono stati associati nel corso degli anni altri composti come ad esempio: l’ aldeide-3-indolacetica, l’ acido indol-3-piruvico, l’ indol-3-etanolo, tutti questi composti per via enzimatica sono convertititi in IAA. La presenza di auxina libera spesso non è rilevabile perché legata a composti proteolitici (chimotripsina) scoperta da Thimann e Skoog nel 1940-42, oppure forma composti di basso peso molecolare con inositolo ed arabinosio. Ad oggi l’IAA riamane l’unica forma di auxina conosciuta in natura. Vista la sua semplice struttura e l’interesse per gli effetti indotti nelle piante in particolar modo la distensione e duplicazione cellulare, la radicazione delle talee sono state sintetizzate numerose auxine sintetiche molto utilizzate nei laboratori di ricerca. Tra queste abbiamo l’ NAA (acido naftalenacetico), l’ IBA(acido indolbutirrico). Nel campo della coltura in vitro sicuramente l’ effetto stimolante della radicazione è quello maggiormente ricercato nell’utilizzo di questo tipo di ormone. Questo effetto fu scoperto in seguito ad un bioassaggio condotto su steli di pisello eziolati. Bisogna comunque precisare che lo stimolo rizogeno dell’auxina dipende molto dal tipo di specie propagata dall’età, dal vigore. È stato osservato (Morini e Fiaschi, 2000) che su corbezzolo, arbutus unedo L., utilizzando IBA a concentrazioni variabili 1.0-2.0-3.0-4.0 mg/l, senza sottoporre i germogli ad un periodo di allungamento, la radicazione non dava risultati. Anzi concentrazioni di IBA a 4.0 mg/l causavano la necrosi degli apici vegetativi. Successivamente sottoponendo i germogli ad un periodo di allungamento di una settimana e ripetendo l’ esperimento con le stesse concentrazioni di IBA si vide come la radicazione desse risultati soddisfacenti. Una probabile spiegazione di questi risultati differenti potrebbe essere dovuta alla presenza di concentrazioni elevate di citochinina assorbita durante la fase di moltiplicazione che, senza successivo periodo di allungamento, avevano un effetto negativo sull’induzione radicale. Risultati ancora migliori si ebbero abbinando al periodo di allungamento e all’utilizzo di IBA, un periodo di buio. L’efficacia di un trattamento auxinico sulla radicazione dei germogli dipende molto dal tipo di specie e dal tipo di auxina utilizzata. Si è osservato che l’ IAA (0.1-1.0 mg/l) è molto efficace su Prunus cerasifera (Hammerschlag, 1982), NAA (0.5-1.0 mg/l) funzona su Salpiglossis e Prunus avium (Snir, 1982).

2) citochinine: un indispensabile ingrediente di molti terreni per la coltura in vitro di cellule vegetali è stato, sino a non molti anni fa, il latte di cocco. Esso stimola la crescita favorendo la divisione cellulare e non è sostituibile da auxine e da gibberelline. Tuttavia i tentativi di isolare il fat­tore ad attività citochininica (citochinesi = divisione cellulare) dal latte di cocco fallirono. Nel 1955 fu scoperta una sostanza, la kinetina, in grado di sostituire il latte di cocco nelle colture in vitro. In seguito anche la 6- benzilaminopurina (6-BAP) si dimostrò utile a tale scopo. Solo nel 1964 fu isolata dalla pannocchia del granoturco (Zea mays) una citochinina na­turale, la zeatina. Poco più tardi venne isolata un'altra- citochinina naturale, denominata 2iP. Risulta evidente da un confronto delle strutture chimiche che tutte le citochinine, sia sintetiche che naturali, hanno in comune il grup­po purinico della adenina. Le citochinine sono presenti soprattutto nei tessuti in attiva divisione. Ma qual è il luogo di sintesi? È ipotesi corrente che esse siano sintetizzate negli apici vegetativi radicali e che da questi vengano trasportate nelle parti aeree della pianta. Gli effetti delle citochinine sulla pianta sono diversi, esse: Stimolano l'espansione fogliare. L'effetto è simile a quello otteni­bile per applicazione di gibberellina alla foglia, mentre le auxine, come so­pra descritto, non hanno alcun corrispondente effetto stimolante. Ritardano la senescenza della foglia, con un effetto simile, in questo caso, a quello delle auxine. Sono indispensabili per la germinazione dei semi. Esse tuttavia non sono presenti nel seme dormiente, ma vi compaiono dopo che la gibberellina ha indotto la comparsa di enzimi idrolitici.Determinano lo sviluppo delle gemme. Per cause ancora sconosciu­te certi organi della pianta non sono, in normali condizioni, raggiunte dal­l'ormone. Ne sono un esempio le gemme ascellari, dormienti a causa della presenza di auxina (dominanza apicale). La citochinina è assente da tali gemme. Una sua applicazione annulla l'effetto inibitorio dell'auxina e de­termina lo sviluppo normale della gemma. La so­miglianza chimica con le basi puriniche degli acidi nucleici ha suggerito che esse possano interferire in qualche modo con qualcuno degli acidi nucleici della cellula. E' stato proposto, ma mai dimostrato inequivocabilmente, che le citochinine agiscano inserendosi nella molecola dei tRNA (RNA di tra­sferimento) ed interferendo così con la sintesi delle proteine. Studi sull'effetto di questa classe di ormoni in cellule vegetali coltivate in vitro stanno fornendo interessanti informazioni: è stato, ad esempio di­mostrato che cellule di soia (Sola hispida) e di tabacco (Nicotiana tabacum) coltivate in vitro sintetizzano normalmente DNA, anche in assenza di cito-chinina, ma non sono in grado di effettuare la mitosi. Ciò ha suggerito che le citochinine possano regolare il ciclo cellulare controllando un evento cri­tico nella transizione dalla fase G2 alla mitosi.  L'aggiunta di citochinine a cellule vegetali, coltivate in vitro ha, come effetto più evidente, un rapido incremento della divisione cellulare. L'effetto è però ottenibile solo in presenza di auxina. Questa attività stimolante la divisione cellulare rappresenta quindi, anche in vitro, la caratteristica distintiva più evidente delle citochinine rispetto agli altri fitormoni. Di estrema importanza per le colture di cellule vegetali in vitro è il rapporto quantitativo tra citochinine ed auxine presenti nei terreni di col­tura. Da esso infatti dipende in molti casi il mantenimento delle cellule al­lo stato indifferenziato o la loro differenziazione in radici e germogli sino allo sviluppo della pianta completa.

3) gibberelline: La storia della loro scoperta è interessante: nel 1926 fu scoperta in Giappone una malattia del riso provocata dal fungo parassita Gibberella fujikuroi. Il fungo produceva una sostanza, la gibberellina, che determinava allungamento del fusto e delle foglie stimolando sia la divi­sione che l'allungamento cellulare. Le piante crescevano, così, sottili e deboli. Solo trent'anni più tardi, con l'isolamento di una sostanza ad azione gibbe­rellinica da una pianta superiore, il fagiolo (Phaseolus vugaris), si ebbe la dimostrazione che anche piante in condizioni fisiologiche normali conten­gono gibberelline e che la malattia del riso era causata quindi da un eccesso di tale sostanza nella pianta. Negli ultimi anni più di trenta differenti gib­berelline sono state isolate da diverse piante. La GA3 è la gibbe­rellina più abbondante nei funghi, le altre gibberelline hanno una struttura chimica simile e differiscono dalla GA3 per piccole modifiche strutturali. Stimolano la crescita delle piante e l'espansione fogliare influendo sia sulla divisione che sull'allungamento cellulare. L'effetto più evidente sulla pianta è un allungamento del fusto che cresce lungo e sottile, con po­chi rami. Sulla capacità di stimolare la crescita di piante nane si basa ap­punto il test biologico più usato. Aumentano le dimensioni dei frutti, specialmente se somministra­te assieme alle auxine. Stimolano inoltre, come le auxine, lo sviluppo di frutti partenocarpici. Interrompono la dormienza del seme, inducendone la germinazione. Studi sul meccanismo di azione delle gibberelline sono stati effettuati prevalentemente su semi di orzo (Hordeum vulgare), soprattutto in rela­zione ai problemi pratici della industria della birra. Quando il seme inizia la germinazione, l'embrione rilascia gibberellina. In risposta a ciò, uno strato di cellule specializzate, le cellule dell'aleurone, produce a-ami­lasi ed altri enzimi idrolitici necessari per l'utilizzazione delle riserve di polisaccaridi presenti nell'endosperma. Sintesi di RNA e di proteine sono indispensabili per la comparsa degli enzimi. Ciò ha suggerito che la gib­berellina possa essere responsabile dell'attivazione dei geni per la sintesi degli enzimi stessi.  Fra i regolatori di crescita sono le meno usate, sebbene in alcuni casi il loro impiego appaia essenziale. Esse favoriscono l’allungamento degli internodi e possono dare buoni risultati nella fase precedente la radicazione deo germogli. La più utilizzata è la GA3 (acido gibberellico). In generale nella coltura in vitro è il giusto bilanciamento tra citochinina e auxina ad influenzare le fasi di proliferazione e radicazione.


4) Acido abscissico (o dormina): è considerato il diretto antagonista dell'azione degli ormoni della crescita (auxine, gibberelline e citochinine). Scoperto, isolato e caratterizzato chimicamente dopo il 1960, esso è identico alla dormina, caratterizzata dalla proprietà di interferire con l'azione stimolante di IAA sullo sviluppo del germoglio. Nulla si conosce sul luogo di sintesi dell'ormone; si sa solo che esso si accumula in particolare nelle foglie e nei frutti poco prima del distacco dalla pianta. Lo si trova, inoltre, nelle gemme e nei semi dormienti. L'acido abscissico : Accelera l'appassimento e il distacco delle foglie e dei frutti.  Inibisce lo sviluppo delle gemme. Le gemme invernali sono ricche di ormone. Inibisce la germinazione del seme durante il periodo di dormienza. L'acido abscissico accelera anche la senescenza di cellule vegetali col­tivate in vitro. E’ stato dimostrato ad esempio che calli di mimosa (Mimosa Pudica) invecchiano e muoiono entro una settimana dall'aggiunta di acido abscissico. Ciò ha permesso di intraprendere una serie di ricerche intese a chiarire il meccanismo con cui l'ormone agisce sul metabolismo cellulare. L'effetto primario non è stato ancora chiarito. Due sono le ipotesi correnti: la prima è che l'ormone agisca alterando l'integrità delle membrane e favo­rendo così la perdita di soluti dalla cellula. La seconda, basata sull'osser­vazione sperimentale che l'acido abscissico induce errori nella sintesi di RNA messaggero, è, invece, che l'ormone interferisca direttamente con la lettura del codice genetico durante la trascrizione.


5) Etilene: è l'ormone a struttura chimica più semplice ed è l'unico, sinora identificato, gassoso a temperatura ambiente. La prima descrizione dei suoi effetti si può già trovare in pubblicazio­ni del 1858, quando si osservò che le piante poste in ambienti riscaldati con stufe a cherosene si sviluppavano in un modo caratteristico. All'inizio del secolo venne chiarito che tali effetti biologici sono provo­cati dall'etilene, un prodotto della combustione incompleta del cherosene. Uno degli effetti più appariscenti dell'etilene, la stimolazione della colora­zione e della maturazione dei frutti, è stato, ed è tuttora, largamente usato in agricoltura. Solo successivamente, cioè dopo il 1930, fu data la spiegazione dei curiosi effetti attribuiti a questo semplice gas: fu scoperto infatti che l'etilene è normalmente presente in natura in diversi tessuti della pianta ove esercita attività di regolazione tipicamente ormonali. L'ormone si trova nei frutti (soprattutto in maturazione), ma anche nei fiori, nelle foglie, nei germogli e nelle radici. Poco si sa sul luogo di sintesi. Durante la germinazione esso è prodot­to nelle cellule apicali. Nella pianta adulta è sintetizzato in sedi diverse (frutto, fiore, ecc.) a seconda della fase di vita della pianta stessa. Maggiori informazioni sì hanno sul meccanismo di biosintesi. Esperimen­ti con precursori radioattivi hanno mostrato che i suoi due atomi di carbo­nio derivano dal carbonio in posizione 3 e 4 della metionina. La sintesi richiede energia fornita dalla attività del mitocondrio. Gli effetti dell'etilene sulle piante sono diversi. Esso: inibisce la divisione cellulare sia nelle radici che nello stelo. E’ stato dimostrato che l'effetto dell'etilene è quello di bloccare il processo mi­totico inibendo la sintesi di DNA nei meristemi. La sintesi di RNA non è, al contrario, inibita; inibisce fortemente l'allungamento cellulare; stimola, come sopra accennato, la maturazione dei frutti; annulla la dominanza apicale e permette alle gemme ascellari di svilupparsi, in modo simile a quanto si ottiene recidendo la gemma apicale; annulla il geotropismo positivo delle radici; è responsabile della curvatura ad uncino dell'apice vegetativo du­rante l'emergenza sotterranea del germinello del seme. Nulla si sa sul meccanismo di azione primario. Gli unici dati speri­mentali concreti, a riguardo, sono quelli che suggeriscono che l'etilene, per agire, debba formare un complesso reversibile con un accettore contenente un metallo, forse rame. Interessanti sono anche le ricerche intese a chiarire la interazione tra l'etilene e gli altri ormoni, soprattutto l'auxina. Ad esempio, sì sa che l'eti­lene è presente negli apici vegetativi, ma negli apici vegetativi è presente anche auxina. Il fatto che l'etilene non inibisca completamente l'allunga­mento e la divisione cellulare dell'apice è quindi probabilmente legato ad un equilibrio tra i due ormoni. Tra le varie osservazioni sperimentali, interes­sante è quella riguardante il fenomeno della curvatura dell'apice vegetativo durante le prime fasi di sviluppo sotterraneo, prima della uscita fuori terra. La curvatura è correlata con la presenza di etilene. Uscendo alla luce l'apice si raddrizza: la luce, o meglio la sua componente rossa (650-700 nm di lunghezza d'onda), esercita infatti un'azione inibitoria sulla sintesi di etilene nell'apice stesso, lasciando quindi via libera all'azione degli al­tri ormoni. Ulteriori osservazioni sperimentali mostrano, d'altra parte, che la sintesi di etilene è stimolata dalla auxina: la somministrazione di au­xina determina infatti, entro mezz'ora, la sintesi di etilene e tale sintesi ter­mina non appena l'auxina viene eliminata. Si sono definiti, quindi, due fattori che possono controllare la concentrazione d'etilene nella pianta. Uno di essi, la luce rossa, ne inibisce la sintesi, un'altro, la auxina, la stimola. Ulteriori ricerche sono ora necessarie per chiarire il significato biologico dì queste osservazioni e per definire altri eventuali meccanismi di controllo della sintesi di etilene.




Caratteristiche di alcuni dei mezzi di coltura piu utilizzati
La scelta del mezzo di coltura è in funzione delle  specie da allevare in vitro. Alcune specie, a differen­za di altre, sono sensibili ad un contenuto elevato di sali, o hanno esigenze diverse per quanto riguarda i fitoregolatori di crescita. L'età della pianta ha inoltre una sua influenza. Per esempio tessuti giovani, gene­ralmente, sono in grado di rigenerare radici con una maggiore rapidita rispetto a tessuti adulti. Il tipo di organo prescelto è inoltre importante, per esempio le radici richiedono tiamina. Inoltre in funzione del­l'obiettivo perseguito, l'apporto di auxine sarà neces­sario per l'induzione di radici mentre l'alterazione del rapporto citochinine/auxine sara fondamentale per l'induzione e lo sviluppo di gemme avventizie. Le formulazioni dei mezzi di coltura sono frutto di prove sistematiche e di sperimentazione. La tabella mette a confronto la composizione di alcuni mezzi di coltura comunemente utilizzati nella coltu­ra di tessuti vegetali in relazione ai loro componenti espressi in milligrammi/litro e concentrazione mola­re. Il mezzo di Murashige e Skoog (MS) (1962) è il mezzo base più comunemente usato e piu idoneo per indurre rigenerazione da tessuti e da callo. Esso fu creato per it tabacco essenzialmente sulla base delle analisi dei componenti dei tessuti di tale pian­ta. E' un mezzo di coltura ad elevato contenuto sali­no a causa dei sali di K ed N. Il mezzo di Linsmaier e Skoog (1965) è, per quanto riguarda la parte inor­ganica, fondamentalmente eguale al mezzo di Murashige e Skoog (1962), mentre dei componenti organici mantiene solamente l'inositolo e la tiamina. Per superare la sensibilita di alcune specie arboree all'elevato contenuto salino, Lloyd e McCown (1980) elaborarono un mezzo di coltura definito Woody Plant Medium (WPM). 
Alcuni dei mezzi di coltura piu comuni vengono commercializzati in polvere, gia pronti per l'uso. II loro impiego è molto semplice ed implica solamente il dissolvimento del contenuto della confezione in uno specifico volume di acqua. Dei mezzi di coltura più utilizzati possono essere acqui­stati separatamente i sali, le vitamine, o l'intero mezzo con o senza fitoregolatori di crescita, agar e saccaro­sio. Tali prodotti sono convenienti, meno soggetti ad errori, e rendono superfluo l'uso di soluzioni concen­trate. Tuttavia, il loro impiego risulta pitt costoso ri­spetto alla preparazione autonoma dei mezzi di col­tura.


Le condizioni ambientali della camera di crescita.

Oltre ai componenti del substrato di crescita, sono importanti le condizioni ambientali che i nuovi espianti troveranno  una volta posti nel contenitore in vetro. A tal proposito devono essere controllati i fattori che determinano l’ambiente di crescita. I contenitori in vetro una volta ricoperti dalla pellicola di film trasparente sono collocati nella camera di crescita. All’interno della camera di crescita devono essere create le condizioni ideali per la vita del germoglio in vitro.
I fattori ambientali più importanti che influenzano la vita dei germogli sono: 

1) Temperatura;
2) Umidità relativa;  
3) Luce.

La temperatura ideale, per le colture in vitro, varia con la specie anche se generalmente si utilizzano temperature costanti di circa 23- 25 °C . A temperature maggiori si ha una maggior accrescimento ma anche problemi di vitrescenza. Inoltre, all’interno l’ umidità relativa può raggiungere la saturazione. Questo fenomeno, dovuto al limitato scambio gassoso con l’esterno per la presenza del film plastico che riveste il vaso, comporta una serie di modificazioni fisiologiche ed anatomiche che rendono il germoglio incapace di regolare la traspirazione tramite l’attività stomatica. Per questo si rende necessario il periodo di acclimatazione. Tuttavia, diminuendo l’umidità relativa si è visto che l’accrescimento dei germogli è consistentemente ridotto.

La luce come fattore di crescita
Una trattazione particolare in merito ai fattori ambientali, che influenzano l’attività delle piante allevate
in vitro, merita la luce. In vivo ad essa viene riconosciuta una duplice funzione:

a) Fonte primaria di energia;
b) Fonte di informazione;

In vitro, infatti l’attività fotosintetica viene alterata dalle condizioni microclimatiche che si creano nel contenitore di vetro. I ridotti scambi gassosi, e quindi la carenza di CO2, dovuti al film trasparente che riveste il vaso e le alterazioni anatomiche e fisiologiche indotte sui germogli da particolari fattori ambientali, non creano le condizioni ottimali per lo svolgimento della normale attività fotosintetica. La fonte di carboidrati per i germogli allevati in vitro deriva, dunque dal substrato, così da considerare le colture eterotrofe e non più autotrofe.
Più che come fonte di energia la luce svolge, per le colture in vitro, una importante funzione di informazione per fenomeni fotomorfogenetici, che si verificano nei diversi stadi della micropropagazione. I diversi fenomeni fotomorfogenetici dipendono essenzialmente da:

1.  fotoperiodo
2. intensità luminosa
3.  qualità della luce 

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