I valori del pH del substrato devono essere tali da consentire la crescita dei tessuti vegetali. Il pH influenza:
- la solubilità dei sali:se è troppo basso i fosfati ed altri sali con alto peso molecolare possono precipitare;
- l'assorbimento degli elementi nutritivi e degli ormoni: con bassi valori di pH le vitamine del gruppo B e l'acido pantotenico, le auxine e l'acido gibberellico diventano instabili ed, inoltre, viene ritardato l'assorbimento degli ioni ammonio;
- la solidificazione dell'agar.
Per questi motivi il range di variazione del pH è abbastanza ristretto ed il valore ottimale per molte specie è compreso fra 5,2-5,8. In questo intervallo i sali si mantengono nella forma solubile, anche in presenza di elevate concentrazioni di fosfati, inoltre questi valori sono sufficientemente bassi per permettere una crescita rapida dei germogli. Durante la sterilizzazione del substrato il valore del pH subisce un abbassamento di circa 0,2-0,3 punti. Si modifica anche durante lo sviluppo della coltura per la metabolizzazione di alcune sostanze.
In alcune specie il pH scende nelle prime due settimane di coltura per poi risalire alla fine della subcoltura. Secondo alcuni Autori ciò è dovuto alla CO2 prodotta dalla respirazione dei vegetali, mentre altri sostengono che la diminuizione del pH è legata all'assorbimento dei cationi presenti nel mezzo, mentre il successivo aumento è dovuto alla metabolizzazione degli anioni, sopratutto quelli nitrici. Per quanto riguarda la stabilità dell'agar, un pH troppo acido determina l'idrolisi dell'agente solidificante durante la sterilizzazione in autoclave, causandone la perdita del potere addensante. Al contrario, un pH troppo alcalino rende il substrato viscoso e ciò rende più difficile lo sviluppo dei germogli.
